支原體qPCR法檢測操作過程  

本流程旨在通過實時熒光定量PCR(qPCR)技術，對樣本中的支原體（Mycoplasma）DNA進行特異性擴增與檢測，以判斷樣本是否受到支原體污染。整個過程包括樣本處理、DNA提取、qPCR反應體系配制、擴增程序運行及結果分析。  

一、實驗前準備  

實驗室分區管理  

遵循“三區原則”：樣本處理區、試劑準備區、擴增與產物分析區，避免交叉污染。  

各區域使用專用移液器、耗材和工作服。  

試劑與儀器準備  

qPCR儀 

離心機、渦旋振蕩器、微量移液器  

支原體DNA提取試劑盒 

支原體特異性qPCR檢測試劑盒（含引物、探針、dNTPs、Taq酶、緩沖液等）  

無菌無酶PCR管、槍頭  

陽性對照（支原體DNA）、陰性對照（無菌水）、內參對照（如18SrRNA，用于檢測提取效率）  

引物與探針設計（若使用自建體系）  

靶基因：常用保守序列如16SrRNA基因或P1黏附蛋白基因。  

探針標記：通常為FAM熒光標記，淬滅基團為BHQ1或TAMRA。  

二、樣本處理與DNA提取  

樣本類型  

細胞培養上清、血清、尿液、拭子樣本等。  

DNA提取步驟（以液體樣本為例）  

取1mL樣本，13,000rpm離心5分鐘，棄上清。  

沉淀中加入裂解液（BufferATL）和蛋白酶K，56℃水浴孵育1小時。  

加入乙醇，混勻后轉移至DNA純化柱。  

依次用洗滌液（AW1、AW2）洗滌。  

最后用50–100μL無酶水洗脫DNA，-20℃保存備用。