干細胞是一類具有無限的或者永生的自我更新能力的細胞、能夠產生至少一種類型的、高度分化的子代細胞[1]。

干細胞被認為可以提供一種理想的生物學平臺, 用于多方面的科學研究與臨床應用, 如藥物篩選平臺的建立、細胞發育與分化的分子調節機制研究、基因靶向敲除動物模型的構建、組織工程種子細胞及基因治療載體的建立、細胞治療及再生醫學等[2]。

干細胞研究離不開干細胞的培養。合格的干細胞培養的過程，包括促進其分裂增殖和維持其未分化狀態。

基于以上兩點要求，目前主流的標準培養方法為飼養層培養法：

即在有絲分裂失活的飼養層細胞 (FEEDER) 上培養干細胞。培養體系一般為高糖DMEM，添加適量的胎牛血清 (FCS) 及白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺等添加劑。

另外，為了避免外源性物質的干擾（如血清、病原等成分）[3]，又嘗試及建立了其他培養基, 包括條件培養基 (CM) 、無飼養層、無血清、血清替代物 (SR) 非條件培養基等。

其中無血清培養基中添加了更多珍貴的細胞因子，而血清替代物培養基則采用人工/半人工合成分子替代物的形式，來替代血清，成本相較于普通胎牛血清*培養基而言，高出不少。

01

飼養層培養法

目前認為，飼養層能夠提供干細胞接觸所必需的復雜蛋白分子。自1981年EVANS等人[4]用飼養層成功培養了mESC起，飼養層培養法便開始不斷發展。實驗過程，主要分為以下三步：配制飼養層細胞培養基、準備飼養層細胞、配制飼養單層細胞培養基、飼養單層制備、配制干細胞培養基、接種干細胞培養。

飼養層培養法卻存在著不可避免的缺點：

1、 飼養層細胞生命期有限，不能在體外長期傳代。在體外傳代時間太長，其產生促增殖因子和抑制分化因子的能力會減弱甚至喪失。

2、 MEF細胞的染色體干擾：飼養層細胞會影響干細胞遺傳物質。　

3、 絲lie霉素-C的影響：飼養層細胞需要用到絲lie霉素-C，該物質可能會影響干細胞的增殖。

4、 異種抗原及污染的影響：飼養層細胞作為異種抗原也會影響干細胞的健康，還有發生細胞間融、引入其他動物源性病原體，給臨床移植治療帶來風險。

5、 所用試劑復雜，批次不可控：所用材料的批次之間的波動，限制了培養物之間的可重復性。

6、 實驗周期長，培養基配制復雜：在基礎培養基的基礎上，添加例如白血病抑制因子（LIF）[6]這樣的多功能細胞因子，但無論進口還是國產的產品，都不免有價格高昂的缺點。而自己配制，又會面臨操作繁瑣、易污染等問題。飼養層培養從培養飼養細胞開始，至少需要一周時間才能得到所需的干細胞，周期過長。

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02

無飼養層培養

無飼養層培養類似普通細胞培養，主要分為以下幾個步驟：培養瓶預處理、配制培養基、消化/復蘇干細胞、接種、培養。

相較于飼養層培養法，無飼養層培養法的優點顯而易見：更加簡便、節省時間；但缺點也十分明顯：

1、 培養的細胞質量不穩定：由于自行配制的培養基，不可控因素較多，缺少營養細胞對的存在，干細胞生長狀況也不穩定，直接影響實驗結果。

2、 成本高昂：商品化的培養基，根據品質不同，價格也是從幾百元到幾千元不等，直接增加了干細胞的培養成本。

3、 需要不斷對培養基進行調整，對實驗人員有很高的要求：無飼養層培養法需要人為添加各種各樣的細胞因子，不同的干細胞還需要進行細微的調整以適應不同的生長需求，因此培養難度更高，對技術人員的操作水平及經驗有很高的要求