上周我們一起討論了基于Venor®Gem qEP試劑盒的支原體qPCR經典檢測法，也是目前使用比較廣泛的方法之一。

當然啦，關于支原體的檢測，方法眾多。今天我們就來了解一下，操作相對更簡單的“一步法"。該方法會用到Minerva Biolabs公司的另一種試劑盒——VenorGeM® OneStep，它與上周介紹的經典法試劑盒類似，都是利用了熒光定量PCR的基本原理。

（前情提要在這里，戳戳下方圖片傳送到經典法支原體檢測試劑盒詳解）

不同的是，“一步法"試劑盒中，直接將內控添加到預混液中，使用起來更加方便、節省時間。

下面我們就來詳細介紹一下VenorGeM® OneStep支原體檢測試劑盒。??

使用方法

步驟

與經典法大致相同：

樣品處理?試劑制備?體系建立?啟動PCR反應?結果判定

樣品處理：

取100μl左右的細胞上清液

95℃孵育后離心，取適量用于后續qPCR。

細胞培養樣品易含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進行樣品穩定化處理。

試劑制備：

將緩沖液、預混液、陽性對照等試劑按照說明書要求，該離心的離心、該混合的混合，處理好后扣緊蓋子備用。

PCR體系建立：

在PCR管中，根據需要，加入樣品、陽性對照、新鮮培養基（陰性對照），并且設置好重復孔，蓋好蓋子，震蕩混勻。

啟動PCR反應：

按照所需參數，設置好PCR儀，啟動程序（具體參數詳見產品使用說明或是締一生物網站，點擊下方閱讀原文即可）。

FAM通道：檢測支原體熒光信號。

HEX通道：檢測內控對照熒光信號

支原體DNA和內控DNA，存在信號之間的競爭性抑制

支原體DNA越多，FAM通道信號越高

檢測內控對照的HEX信號通道信號越低。

定量需要基于Ct值和DNA標準曲線

Ct＜40為陽性結果。Ct≥40為陰性結果。

小結：

總的來說，一步法試劑盒是經典版試劑盒的升級版。

在以下幾個方面都是相同的：

①都具有高特異性：一次即可涵蓋所有常見易感染細胞的支原體物種（包括歐洲藥典規定的9種支原體）。與細菌和真核DNA無交叉反應。

②都具有高靈敏度：最高檢測限可達到10CFU/ml。

③都具有相應配套的支原體基因組DNA和細菌基因組DNA，便于特異性驗證。

④都有相應配套的支原體絕對定量標準品，便于最后定量檢測。

不同之處在于，一步法試劑盒省去了配置內控對照的環節，為實驗人員節省了寶貴時間，但相應的，價格也會比經典法試劑盒高出一部分。