在細胞培養過程中，支原體感染發生率達到63%，因而細胞培養過程中被支原體污染是一個世界性的難題。細胞培養中常遇見的有細菌污染、真菌污染、支原體污染、病毒污染等。說起支原體污染，估計細胞培養的同學就開始犯愁了，細胞培養的老手都知道，支原體污染非常不易察覺。有的實驗室被支原體污染后，如果不進行有效*的支原體清除，該實驗的細胞培養很難進行下去，細胞傳代3代以后狀態就急劇下滑，無法進行正常實驗，有的實驗室甚至只能指望換細胞間。那么怎樣才能有效檢測并清除支原體污染呢?

支原體污染的來源包括工作環境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。細胞培養工作中，主要從以下幾個方面來預防支原體的污染：控制環境污染；嚴格實驗操作；細胞培養和器材要保證無菌；在細胞培養中加入適量的抗生素。

據了解，抗生素不能*根zhi支原體感染，停藥后一段時間可以復發。因此，本文著重講述細胞支原體污染預防之支原體快速檢測和環境空間消毒方案，從根本入手預防解決細胞培養支原體污染問題。

1、支原體檢測

市場上支原體檢測方案琳瑯滿目，我們在做細胞培養時肯定不想在支原體檢測上花費一天的時間，哪種方案最為快速有效？在這兒介紹一種可以在30分鐘內完成支原體檢測的試劑盒，該試劑盒是由我國蘇州先達基因公司研發的，其原理是基于公司自主開發的實時熒光恒溫核酸檢測技術（ERA），可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對痕量的支原體種內保守性DNA片段進行特異性的擴增，擴增反應可以在20min內完成，該試劑盒檢測范圍涵蓋130種支原體。

ERA核酸擴增技術的核心是一套等溫核酸擴增組合酶制劑。通過酶工程改造，將來源于細菌和病毒的特定工具酶進行改造突變并篩選其功能，通過不同的DNA擴增反應體系進行優化組合，從而獲得8種酶蛋白為核心的等溫擴增體系。配好的反應體系在各種實時熒光定量儀或者先達基因自主研發的簡易恒溫熒光檢測儀中，可實現恒溫擴增與熒光信號檢測于一體，通過實時熒光擴增曲線在20min內就可通過檢測儀的顯示屏讀出檢測結果，檢測過程無需開蓋，避免氣溶膠的產生，結果可靠性大幅度提高。ERA結合先達基因提供的一步法提取DNA的試劑，進一步簡化了支原體檢測操作，5min完成細胞液的DNA提取，20min完成支原體DNA分子檢測，整個過程只需30min。

2、環境空間消毒方案

環境空間消毒包括：環境空氣消毒、物體表面消毒、生物安全柜或超凈工作臺滅菌及培養箱消毒。目前大多數細胞培養室只是簡單安裝了臭氧消毒機，而從建立使用到后期從來沒有經過大消毒（熏蒸滅菌），這給細胞培養環境微生物污染帶來了極大的隱患和風險，因為臭氧消毒能力有限不穩定而且不能全面覆蓋，無法殺滅微生物休眠體，單純的臭氧消毒已不能深入的解決環境微生物問題，只能說是一種微生物水平控制的輔助手段。根據美國FDA、新版GMP及相關國際組織，現行的主流無菌室環境空間消毒是H2O2氣體滅菌，環保無毒無殘留，安全又快速。H2O2氣體滅菌應用于細胞培養室消毒代替甲醛熏蒸將成為未來趨勢。

H2O2干霧氣體能快速殺滅細菌、真菌、支原體及病毒，法國歐菲姆H2O2干霧滅菌新技術應用于細胞培養室環境消毒則更具創新性和實用適用價值。

環境及人員操作污染風險大，干霧滅菌方法能把這種污染風險降至低，其靈活消毒的特點更能為微生物防控提供有力支撐，細胞房環境、培養箱等均可輕松進行滅菌處理而無需再投入過多的人力和物力，平常消毒及應急消毒可謂獨yi無二。

法國歐菲姆H2O2干霧滅菌器源于歐盟GMP設計，自身符合潔凈區凈化要求，不帶入任何外源污染的同時高效治療潔凈室空間微生物，達到無菌凈化的目標。采用了先進的霧化技術，霧化顆粒小于3微米，增效了空間擴散均勻性，迅速彌漫充滿整個密閉空間不放過每一處死角，滅菌效果堪稱空qian絕hou，其均勻性、無殘留及對機器無傷害特征非常吻合細胞房環境消毒及培養箱里面消毒。

歐菲姆干霧H2O2滅菌器源于歐洲法國，專門針對潔凈廠房無菌室GMP設計，適應大空間滅菌，小空間滅菌更靈活。采用了先進霧化技術，霧化粒徑平均達到3—5微米，配合空間殺孢子劑使用，滅菌效果能對嗜熱脂肪桿菌芽孢降低6個對數值。

歐菲姆原理：歐菲姆采用獨到而特殊的結構設計，使得在僅僅輸入電能的情況下，集壓縮、ventur噴射和霧滴內外部濺射碎化功能于一體，使專用液態殺孢子劑變成氣霧狀態極微小顆粒噴出，高速極小微粒與空氣接觸后充分氣化，變成氣態H2O2即為“干霧"。

深圳潤聯利用歐菲姆H2O2干霧滅菌器，針對不同行業的實驗室以及醫療機構，會提出不同環境消毒控制經驗，無論是P3實驗室，無菌制劑生產車間，SFP動物實驗室，深圳潤聯均有針對所在行業的具體空間消毒方案。

德國MB生產的Mycoplasma-offTM噴霧劑，或濕巾擦拭 5-10分鐘清除，對支原體、細菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性，操作簡單方便。

qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規PCR基礎上，將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標記，使PCR擴增后的產物帶有熒光，利用熒光信號的變化和配套軟件，進行DNA擴增反應的實時監測，簡稱qPCR。

優點：①靈敏度高、特異性強。

②時間短，2-3小時出結果。

③檢測結果可定量。

④操作簡便。

缺點：①對于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結果會出現假陽性。（可用培養法做補充驗證）

②不同廠家生產的試劑盒質量差異巨大（由于引物及內在設計不同），需謹慎選擇，盡量在專業人員推薦指導下使用。